Methylierungsspezifische PCR (MSP)

Methylierungsspezifische PCR (MSP)


DNA kann auf verschiedene Weisen modifiziert werden. Eine Variante ist die sog. DNA-Methylierung der Base Cytosin in der Basenfolge Cytosin-Guanin. Dabei wird eine CH3-Gruppe auf die Base Cytosin übertragen, es entsteht die Base 5-Methylcytosin.

Die DNA-Methylierung spielt eine Rolle z. B. bei der DNA-Reparatur, der Regulierung der Genexpression oder der Stabilität der Chromosomen.

Mitte der 90er Jahre wurde eine Methode entwickelt, die die Unterscheidung von methylierten und unmethylierten Cytosinen mittels PCR ermöglicht. Dazu muß die extrahierte DNA mit Natriumbisulfit behandelt werden. Dieses greift die CH3-Gruppe der Base Cytosin an und deaminiert diese zu Uracil, wohingegen die Base 5-Methylcytosin als Cytosin erhalten bleibt. Bei der anschließend durchgeführten PCR wird an der Stelle des Uracils ein Thymin eingebaut. Die Base 5-Methylcytosin bleibt unverändert und wird in der PCR als Cytosin dargestellt. Der Einsatz von methlyierungs-spezifischen Oligonukleotiden in der PCR, ermöglicht die Unterscheidung von methylierter und unmethylierter DNA.

Schematische Darstellung der Natriumbisulfitkonversion:

5´-TCC*GA-3´    DNA mit einem Cytosin und einem 5-Methyl-Cytosin (C*)

5´-TUC*GA-3´     Die Behandlung der DNA mit Natriumbisulfit führt zur Deaminierung des unmethylierten Cytosin zu Uracil (U) wohingegen das methylierte Cytosin als Cytosin erhalten bleibt.


Auf nachfolgendem Agarosegel ist das PCR-Produkt einer methylierungsspezifischen PCR für die Angelman- und Prader-Willi-Diagnostik aufgetragen. 100 bp = 100 Basenpaar-Leiter, AS = Angelman-Patient, PWS = Prader-Willi-Patient, NK = normal-Kontrolle von einem unauffälligem Patienten.

 

 

 100 bp        AS            PWS           NK                          100 bp            

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