Line-Probe-Assay

Line-Probe-Assay

Der sog. Line Probe Assay ermöglicht den gleichzeitigen in-vitro Nachweis einer bestimmten Anzahl bekannter Mutationen. Er basiert auf dem Prinzip der reversen Hybridisierung. Dabei sind auf einem Membranstreifen Oligonukleotidsonden in parallelen Banden immobilisiert.

Zunächst werden mittels PCR spezifische biotinylierte Amplifikate, die die potentiellen Mutationen erfassen, erzeugt. Durch eine chemische Denaturierung der Amplikons wird die DNA einzelsträngig und kann in einem Hybridisierungsschritt an die Oligonukleotidsonden auf dem Membranstreifen binden. Nach der Hybridisierung wird mit Streptavidin markierte alkalische Phosphatase zugegeben, es kommt zur spezifischen Bindung zwischen Streptavidin den biotinylierten Amplifikaten. Anschließend wir ein chromogenes Substrat hinzugegeben, das von der Phosphatase umgesetzt werden kann und als bräunlich-violetter Niederschlag ausfällt. Überall dort, wo ein PCR-Amplifikat auf dem Membranstreifen gebunden hat, kommt es zu einer Färbereaktion. Da sowohl Oligonukleotidsonden für den Wildtyp wie auch für die zu untersuchenden Mutationen aufgetragen sind, kann man bei der Auswertung zwischen gesunden Normalen, gesunden Trägern und Erkrankten unterscheiden.