DNA Sequenzierungsanalyse

DNA-Sequenzierung

 

Die Sequenzierung der DNA ermöglicht die exakte und gezielte Bestimmung der DNA-Basenfolge. 1977 stellte der Wissenschaftler F. Sanger seine Didesoxy- oder auch als Kettenabbruch- bezeichnete Methode zur Sequenzierung der DNA vor. F. Sanger wurde 1980 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet.

Die Sequenzierungsreaktion beruht auf dem Prinzip einer klassischen PCR, allerdings werden zusätzlich zu dem Nukleotid-Mix auch fluoreszenz markierte Didesoxy-Nukleotide (Stopnukleotide, ddNTP) eingesetzt. Dabei ist jede der vier Basen mit einem unterschiedlich fluoreszierenden Farbstoff markiert. Wird nun während der Elongationsphase in der PCR ein ddNTP in das entstehende PCR-Produkt eingebaut, kommt es zum Stop der PCR-Reaktion, dem sog. Kettenabbruch. Da der Einbau der ddNTP´s zufällig geschieht, erhält man viele unterschiedlich große, Fluoreszenz-markierte PCR-Fragmente. Diese Fragmente können mittels Kapillarelektrophorese aufgetrennt werden. Ein Laser detektiert dabei die einzelnen Fluoreszenzsignale, eine spezielle Computersoftware kann diese Signale Basen zuordnen und eine DNA-Sequenz erstellen.

In der Routine wird die DNA-Sequenzierung zum Nachweis bekannter und unbekannter Mutationen verwendet.

ABI_2 ABI_1

Sequenzierung_Mischsequenz